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實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，將組織剪成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復此步驟2-3次，直至組織被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；

2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；

5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

細胞簡介：

人真皮成纖維分離自真皮組織；真皮，位于表皮深層，向下與皮下組織相連，真皮結(jié)締組織的膠原纖維和彈性纖維互相交織在一起，埋于基質(zhì)內(nèi)。其內(nèi)分布著各種結(jié)締組織細胞和大量的膠原纖維彈性纖維，使皮膚既有彈性，又有韌性。其由兩層組成——乳頭層與網(wǎng)狀層。真皮的結(jié)構(gòu)組成是膠原蛋白、彈性纖維以及基質(zhì)。成纖維細胞（Fibroblast）是疏松結(jié)締組織的主要細胞成分，由胚胎時期的間充質(zhì)細胞分化而來。成纖維細胞較大，輪廓清楚，多為突起的紡錘形或星形的扁平狀結(jié)構(gòu)，其細胞核呈規(guī)則的卵圓形，核仁大而明顯。成纖維細胞功能活動旺盛，細胞質(zhì)嗜弱堿性，具明顯的蛋白質(zhì)合成和分泌活動，在一定條件下，它可以實現(xiàn)跟纖維細胞的互相轉(zhuǎn)化；成纖維細胞對不同程度的細胞變性、壞死和組織缺損的修復有著十分重要的作用。剛分離的真皮成纖維細胞呈圓形、折光性良好，懸浮于培養(yǎng)基中。30min細胞貼壁，其中部分開始伸出偽足，表現(xiàn)為小的突起；6h后細胞基本貼壁，伸展成梭形，胞核清晰，分布較均勻，散在生長，不聚集成團；細胞生長迅速，5-7天即呈融合狀態(tài)，細胞排列緊密，有的交叉重疊生長，平坦、胞體較大，細胞質(zhì)透明，細胞核較大，呈橢圓形，顏色淡。細胞融合，并彼此連接成網(wǎng)狀；細胞呈突起的紡錘形或星形的扁平分布。真皮成纖維細胞在生理條件下的主要功能包括：構(gòu)造和維持組織的正常形態(tài)，合成和釋放細胞外基質(zhì)以及組織損傷后及時大量聚集修復損傷組織。

方法簡介：

公司實驗室分離的人真皮成纖維采用先消化、后-膠原酶混合消化法結(jié)合差速貼壁法制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

質(zhì)量檢測

公司實驗室分離的人真皮成纖維經(jīng)Vimentin免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基 含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細胞形態(tài) 成纖維細胞樣

傳代特性 可傳5代左右；3代以內(nèi)狀態(tài)佳

消化液 0.25%

培養(yǎng)條件 氣相：空氣，95%；CO2，5%

注意事項：

1. 收到細胞后首先觀察細胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請及時和我們聯(lián)系。

2. 仔細閱讀細胞說明書，了解細胞相關(guān)信息，如細胞形態(tài)、所用培養(yǎng)基、血清比例、所需細胞因子等，確保細胞培養(yǎng)條件一致，若由于培養(yǎng)條件不一致而導致細胞出現(xiàn)問題，責任由客戶自行承擔。

3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表面，顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)。因運輸問題，部分細胞由于溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片，是正?，F(xiàn)象。觀察好細胞狀態(tài)后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置4-6h。

4. 貼壁細胞可以消化，懸浮細胞直接混勻收集細胞，900 rpm-1000 rpm離心3 min，棄上清。加5 mL PBS重懸細胞，再900 rpm-1000 rpm離心3 min，，用新鮮的*培養(yǎng)基重懸細胞，并接種到新的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

5. 請客戶用相同條件的培養(yǎng)基用于細胞培養(yǎng)。

6. 建議客戶收到細胞后前3天各拍幾張細胞照片，記錄細胞狀態(tài)，便于和我司技術(shù)部溝通交流。由于運輸?shù)脑颍瑐€別敏感細胞會出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請及時和我們聯(lián)系，告知細胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤回訪直至問題解決。

7. 該細胞僅供科研使用。

8. 備注：運輸用的培養(yǎng)基(灌液培養(yǎng)基)不能再用來培養(yǎng)細胞，請換用按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞。收到細胞后次傳代建議1：2傳代 。

9.注意： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿。不是1個T25瓶傳2個10cm皿。

公司正在出售的產(chǎn)品：

人載脂蛋白B100(apo-B100)ELISA 試劑盒

Human tumor specific aigen (TSA) ELISA Kit 人腫瘤特異性抗原(TSA)檢測試劑盒

HumanADisiegrinAndMetalloprotease8,ADAM8ELISAKit 人解整合素樣金屬蛋白酶8(ADAM8)檢測試劑盒 96T/48T 進口分裝

Humaninsulinaoaibodies,IAA檢測試劑盒人胰島素自身抗體(IAA)檢測試劑盒規(guī)格：96T/48T

組織基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-9)琥珀酰明膠法比色定量檢測試劑盒20次

HumanLegionellaaibodyIgM，LPAb-IgMELISAKit人軍團菌抗體IgM(LPAb-IgM)檢測試劑盒規(guī)格：96T/48T

AKT3重組小鼠 AKT3 蛋白 (aa 106-479, His & GST 標簽) Protein

甘露糖受體C1樣蛋白1(MRC1)重組蛋白 Recombinant Mannose Receptor C Type 1 Like Protein 1(MRC1)

CDH1重組人 E-Cadherin / CDH1 / E-cad / CD324 蛋白 (Fc 標簽) Protein

IL9 Protein Human 重組人 IL-9 / Interleukin-9 蛋白

FCGR2B Protein Cynomolgus 重組食蟹猴 CD32b / FCGR2B 蛋白

FK506結(jié)合蛋白樣蛋白(FKBPL)重組蛋白 Recombinant FK506 Binding Protein Like Protein (FKBPL)

IL9 Protein Human 重組人 IL-9 / Interleukin-9 蛋白

TFPI2重組小鼠 TFPI2 / PP5 蛋白 Protein

ERBB2 Protein Rat 重組大鼠 HER2 / ErbB2 蛋白

FKBP7重組人 PPIase / FKBP7 蛋白 Protein

豚鼠白三烯D4(LTD4)ELISA 試劑盒 96T/48T

Rat angiotensin II (ANG- II) ELISA Kit 大鼠血管緊張素Ⅱ(ANG-Ⅱ)檢測試劑盒

humansinglesandedDNAAibody,ssDNAELISAKit 人抗單鏈DNA抗體/變性DNA抗體(ssDNA)檢測試劑盒 96T/48T 進口分裝

HumanCyclin-dependekinase7,CDK-7檢測試劑盒人周期素依賴性激酶7(CDK-7)檢測試劑盒規(guī)格：96T/48T

組織GSK3α激酶活性定量檢測試劑盒(A/B/C)20次

HumanPolymorphonuclearElastase,PMNElastaseELISAKit人多形核白細胞彈性蛋白酶(PMNElastase)檢測試劑盒規(guī)格：96T/48T

人真皮成纖維細胞人脂蛋白脂酶(LPL)ELISAKit   ELISA.   96T/48T

中文名稱   方法   規(guī)格

人糖原0酸化酶同工酶II(GP-II)ELISAKit   ELISA.   96T/48T

人糖原0酸化酶同工酶MM(GP-MM)ELISAKit   ELISA.   96T/48T